摘要：
胰腺癌是一种恶性程度极高、预后极差的消化系统肿瘤，在过去的40年中其临床疗效一直无所突破。目前，手术切除是唯一可能治愈胰腺癌的方式，但这种方式通常只有20%病患适用，因此患者能否接受手术治疗又是一个难题。
由于缺乏可应用于下游分析的生物标志物，胰腺癌的治疗一直无所进展。CTC（循环肿瘤细胞）虽然是一个极佳的生物标志物，但是在血液中数量极其稀少，导致捕获率低，从而无法体外扩增，应用于下游的进一步研究，如靶点发现、疗效监控及癌症侵袭性评估等。
本篇是全世界唯一关于胰腺癌体外扩增成功的报告。我们通过使用高通量、无需使用抗体或特殊试剂、基于大小的物理特性Labyrinth® Chip，从10位局部晚期胰腺癌病患外周血中富集CTC细胞，均获得成功，其中3位病患成功体外扩增。这些扩增的细胞株不仅与实体瘤分子结构及细胞功能相匹配，而且成功移植在PDX模型上。上述研究成功证明CTC体外培养是可行的，更为胰腺癌研究提供宝贵资源，如癌症如何转移及耐药性的产生等。
另外，胰腺癌患者在接受化疗后， CTC数量虽然下降，却具有更高的EMT类细胞比例，表明胰腺癌的侵略性。
讨论：
尽管胰腺癌的临床前和临床研究已经进行数十年，但晚期胰腺癌生存率并没有显著改善，主要因为缺乏用于评估侵袭性、发病机制及用药后疗效的生物标记物，导致新型疗法的研发一直止步不前。鉴于穿刺活检的入侵性及相关风险，在胰腺癌病患中连续使用以评估治疗效果是不切实际的，但外周血中的CTC却可以克服这个困境。通过抽血的方式可随时随地获得CTC来应用于下游研究，却又避免穿刺活检带来对应的风险。
CTC除了可以计数外，还可以用于体外扩增。这些扩增的细胞株不仅可用于功能性研究、拓宽肿瘤生物层面的认知（如侵袭或转移），还可用于用药指导。此外，通过研究细胞株亚型，可设计针对多种不同亚型分类的个性化治疗方案，为彻底治愈胰腺癌开辟新的路径。至今为止，在其他文献中虽然有报道过CTC体外扩增成功的研究（如乳腺癌、结肠癌和肺癌等），却还没有发现胰腺癌的成功案例。本研究共有10位局部晚期胰腺癌病患入组，通过使用Labyrinth® Chip，均富集CTC成功，并且其中3位病患的CTC成功体外扩增。本次捕获的CTC大部分用于体外扩增，小部分用于评估及判断CTC亚型分类如上皮细胞阴性及EMT（上皮间质转化）类。
在上述扩增成功的细胞株中，均发现上皮细胞阴性及大量的EMT类的细胞，表明胰腺癌具有侵略性，还发现与实体瘤相匹配的KRAS G12/G13基因突变。除此之外，无论是2D或者3D培养，每一个细胞株都有一个不同的主导表现型，并且在传代多次后，会导致某个细胞占比过多。因此为了让研究更具有代表性，我们限制最多只能扩增传代10次，但是必须注意的是这些细胞株都均可传代10次以上。通过扩增，观察到这些细胞株表现出多种显著的表现型差异，如从上表皮类到EMT类细胞，并且每个细胞株的增殖速度也不同。另外，我们无法从细胞株的表现型预测其分子型。例如，2号患者的细胞株表型在2D表现为纺锤状（spindle like morphology），3D表型为松散球状（loosely packed spheroids），但其Vimentin表达却比其他病患的细胞株少了很多。这表明仅通过检测CTC基因突变是不够的，更突出多组学研究的重要性。
本次研究是首次向全世界展示胰腺癌体外扩增，这次的成功主要归因于使用Labyrinth® Chip大量捕获CTC。通过建立PDX模型，细胞株在小鼠体内展现出与病患常见的转移部位，如肝、肠及腹水症状。这个结果进一步阐明通过使用体外扩增可理解胰腺癌转移。
因为缺乏疗效的反馈指标，目前胰腺癌患者的治疗方法十分有限，通常会根据肿瘤进行分期治疗。通过使用Labyrinth® Chip捕获CTC并体外扩增，并进行药敏测试，可成功填补这个空白。目前最常见2种药敏测试方法是MTT测试细胞毒性及流式细胞仪分析DNA损伤及细胞周期。
在对比三位患者的化疗前和化疗后的CTC，观察到EMT类CTC在接受吉西他滨（gemcitabine）化疗后占比大幅增多。CTC不仅可以追踪数量变化量，还可用以评估化疗对于胰腺癌病患CTC表现型的影响。目前我们正在规划及实施大规模的胰腺癌临床研究，以收集更多病患在不同治疗周期的样本。这项研究将持续追踪CTC表现型对于不同治疗阶段的反馈，从而可了解药物应答及病患结果的相关性。本次研究一旦完成，将会进一步阐明胰腺癌转移机制及治疗对于CTC显现型及基因型的影响。
结论：
在本次实验中，我们证明使用Labyrinth® Chip可捕获胰腺癌病患的CTC并可用于体外扩增。在10名入组胰腺癌病患中，我们观察到每位病患CTC浓度、EMT类细胞和上皮类细胞之间比例差异很大。在对比其中3名病患化疗前和化疗后CTC数量，在治疗后病患的CTC虽然有所减少，却有更高比例EMT类细胞。这些EMT类细胞体现出胰腺癌的侵袭性。
通过使用对比捕获的CTC与用其扩增的细胞株，两者分子结构及上皮型和间质型细胞比例并无明显差别，因此细胞株可用于判断患者疾病特征，如细胞表现型，基因突变位点及治疗效果。此外，细胞株还可以用于用药指导，在使用吉西他滨和5FU进行药敏测试后，发现不同的药效反馈。
本次研究通过体外扩增胰腺癌CTC实现对其进行药敏测试以及病患的疗效监控，但更长远的意义还在于为彻底治愈胰腺癌打开了新的路径。